Kasutaja:Lleas/liivakast
![]() | See on kasutaja Lleas liivakast. Kasutaja liivakast on kasutajalehekülje alamleht. Siin kasutaja katsetab või valmistab ette loodavaid artikleid. See ei ole entsüklopeediaartikkel. Enda liivakasti loomiseks klõpsa siia. |
RecBCD (EC 3.1.11.5) on ensüümkompleks, mis E. coli bakteris algatab rekombinatsioonilise DNA reparatsiooni. Ensüüm on võimeline parandama kaheahelalisi katkeid, mis võivad tekkida näiteks ioniseeriva radiatsiooni, replikatsioonivigade, endonukleaaside tegevuse tulemusena, oksüdatiivse kahjustuse või muude faktorite tõttu. RecBCD omab kahte põhilist funktsiooni: ta käitub üheaegselt helikaasina, mis keerab DNA ahelad lahti ning eraldab need üksteisest ning nukleaasina, mis teeb DNAsse üheahelalisi katkeid.
Struktuur
[muuda | muuda lähteteksti]Ensüümkompleks koosneb kolmest alaühikust: RecB, RecC ja RecD. Sellest tulenevalt on kompleks saanud ka oma nime. (joonis 1) Enne recD geeni avastamist tunti kompleksi „RecBC“ nime all. Iga alaühik sünteesitakse vastava geeni poolt.
Funktsoon
[muuda | muuda lähteteksti]Nii RecB kui ka RecD on mõlemad helikaasid ehk ATP-sõltuvad molekulaarsed mootorid, mis harutavad DNA ahelaid üksteisest lahku. RecB alaüksus toimib lisaks sellele ka nukleaasina. RecBCD kompleks (võib-olla ka vaid RecC alaüksus) tunneb ära spetsiifilise DNA järjestuse, 5'-GCTGGTGG-3', mida nimetatakse Chi-järjestuseks (seda tähistatakse ka kreeka tähega χ). RecBCD on helikaaside hulgas omapärane, kuna kompleksis on kaks helikaasi, mis liiguvad erineva kiirusega ning need tunnevad ära Chi-järjestuse, mis võib nende struktuuri muuta. RecBCD seondub lineaarse kaheahelalise DNA otsa. Seejärel liigub RecD helikaas mööda 5' otsaga ahelat, kust algatatakse ahelate lahtiharutamine. RecB teeb sama 3' otsaga ahelal. Kuna RecB töötab aeglasemalt kui RecD, kuhjub üheahelaline DNA RecB ette. Selle tulemusena tekivad DNA struktuurid kahe üheahelalise sabaga (lühem 3' otsaga saba ja pikem 5' otsaga saba) ja üheahelalise silmusega 3' otsaga ahelas. Neid struktuure on nähtud elektronmikroskoobi abil.
Mehhanism
[muuda | muuda lähteteksti]DNA molekuli lahtiharutamisel võib RecB toimida erinevalt vastavalt keskkonnas olevatele ainetele, ennekõike Mg2+ ioonide ja ATP kontsentratsioonide suhtele. Kui ATP-d on liias siis ensüüm lõikab katki vaid ahela, millel asub Chi-järjestus (järjestus, mis oli algselt 3' otsaks). Ahelate lahti harutamine jätkub ning tekib üksik 3' otsaga ahel, mille tipus on ka Chi-järjestus. See saba saab seostuda RecA valguga, mis viib läbi ahelate vahetust terve homoloogse DNA ahelaga ehk rekombinatsiooni. Kui RecBCD jõuab ahela lõppu, lasevad ensüümkompleksi alaühikud ahelast ning üksteisest lahti ning ensüüm jääb inaktiveerituks vähemalt tunniks. RecBCD molekul, mis käitus nagu Chi, ei seondu mõnele teisele DNA molekulile. Keskkonnas, kus Mg2+ ioonid on liias, lõikab RecBCD ensüüm mõlemad DNA ahelad endonukleaasselt, kuigi 5' saba lõigatakse harvemini kui 3' saba. Kui RecBCD satub 3' otsaga ahelal Chi-järjestusele, siis ahelate lahtiharutamine peatub ning 3' otsaga ahela töötluse kiirus väheneb. Lahtiharutamise jätkudes lõhutakse nüüd vastasahelat (5' otsaga ahelat) ning RecA valk laetakse 3' otsaga ahelale. Peale ühe DNA molekuli protsessimise lõppu jätkab ensüümkompleks koheselt tööd mõne teise DNA molekuliga, kus viiakse läbi sama protsess. Kuigi mitte kumbagi protsessi ei ole rakusisese DNA puhul veel katsete analüüsi kaudu tuvastatud tänu nende toimumise kiirusele, viitavad geneetilised tõendid asjaolule, et reaalselt toimib RecBCD poolt läbi viidav rakusisene DNA töötlus pigem selliselt, nagu on täheldatud ATP liias toimuva protsessiga. Näiteks need RecBCD mutandid, kel puudub tuvastatav endonukleaasne aktiivsus, säilitavad rakkudes kõrge Chi aktiivsuse. Chi saidi olemasolu ühel DNA molekulil rakus vähendab või eemaldab Chi aktiivsuse teistel DNA molekulidel, seda tõenäoliselt seetõttu, et Chi-sõltuv RecBCD lagundamist on täheldatud in vitro keskkonnas, kus on ATP-d liias ning seetõttu lõigatakse DNA-d Chi saidis. Mõlemal tingimusel jääb 3' otsaga ahel Chi saidist allapoole terveks. Seejärel laetakse RecA valk RecBCD poolt aktiivselt 3' otsa. Mingil siiani määramata ajahetkel laseb RecBCD DNA molekulist lahti. Ensüümkompleks on võimeline lahti harutama vähemalt 60 kb jagu DNA ahelat ilma sellelt lahti tulemata. RecA algatab DNA ahelate vahetuse selle ahela, millele ta on seotud ja mõne identse või peaaegu identse terve DNA ahela vahel. Selle tulemusena tekib liidetud DNA molekul, mis arvatavasti omakorda korrigeeritakse kas replikatsiooni abil, mis saab alguse 3' otsaga ahela pealt, mis sisaldab Chi-järjestust või siis Holliday ühenduse tekitamise kaudu. Holliday ühendus muudetakse lineaarseks DNA molekuliks tänu RuvABC kompleksile või harutatakse see lahti RecG valgu abil. Mõlemal juhul luuakse terviklikud DNA molekulid kus on järjestus muutunud võrreldes esialgse järjestusega. See protsess, mida tuntakse ka homoloogilise rekombinatsiooni all, lõpetab DNA reparatsiooni kaheahelalise katke puhul.
Rakendused
[muuda | muuda lähteteksti]RecBCD on mudelensüüm, mille abil on võimalik uurida üksiku molekuli fluorestsentsi. Tegu on eksperimentaalse meetodiga, mille abil on võimalik uurida ja paremini mõista valgu-DNA interaktsioone. Ensüüm on samuti kasulik lineaarse üksik- või kaksikahelalise DNA eemaldamisel DNA rõngasmolekulide preparaatidest, kuna kompleks vajab funktsioneerimiseks lahtist DNA otsa.